| 更新時間： | 2025-02-17 |
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| 廠商性質(zhì)： | 生產(chǎn)廠家 |
本品用于分離大鼠外周血NK細(xì)胞 Store at: RT° C Size :3X100ml試劑盒內(nèi)容試劑：全血及組織稀釋液 100ml試劑：細(xì)胞洗滌液 100ml試劑B： 100ml試劑D： 100ml試劑E： 100ml說明書 1份
大鼠外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：3×100ml/Kit
試劑盒內(nèi)容：
全血及組織稀釋液 100ml
細(xì)胞洗滌液 100ml
試劑 B 100ml
試劑 D 100ml
試劑 E 100ml
說明書 1 份
大鼠外周血NK分離液試劑盒
1. 適用于各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索
2. 相關(guān)試劑及耗材
3. 注意事項(xiàng)
4. 應(yīng)用
5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)
6. 貯藏及保存期限
7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
8. NK 細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例
9. HES-TBD550 使用說明
10. 組織單細(xì)胞懸液的制備
11. 生產(chǎn)企業(yè)
12. 參考文獻(xiàn)
2. .. 注意事項(xiàng) A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
B． 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一
定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，
且所有操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。
C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響
分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件
各實(shí)驗(yàn)室自定）。
D． 使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。
E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑
體積。
F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及
紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、
低內(nèi)毒素水平且無細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。
4. .. 應(yīng) 4. 用
適用于從人或各種動物血液或臟器組織中分離 NK 細(xì)胞。
5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下
6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限
18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。
注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
7. .. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
A． 試劑
NK 細(xì)胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、胎牛血清
B． 器材 玻璃離心管、玻璃滴管 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無菌工作臺
A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）；
B．取 1ml新鮮抗凝血或組織單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×108
-1×109個/ml，具體制備方法參照“10.組織單細(xì)胞懸液的制備”）與試劑E 1：1混合后再按2:1的比例與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）混勻。20℃-30℃靜置20-30分鐘，吸取上層渾濁液備用，棄去大部分紅細(xì)胞；
C．將步驟B中吸取的上層渾濁液小心加于D液之液面上；
D. 以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子)；
此時離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層；為上清液層（包含血小板和血漿）。第
二層；；；；為 NK 細(xì)胞層。。。。第三層；為渾濁分離液層（含大量 T、B 及粒細(xì)胞）。第四層；為極少量紅細(xì)胞層。收集第二層 NK 細(xì)胞放入含 4-5ml 細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需 NK 細(xì)胞。
注：：：：A. 提取率約為 80%。
B．分離大量樣品時，具體操作方法請參照我公司“淋巴細(xì)胞快速分離技巧”，查詢路徑：
HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復(fù)合物，其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基
取代度即取代級、平均分子量決定。大量實(shí)驗(yàn)表明平均分子量越大對紅細(xì)胞的凝集作用越強(qiáng)，
有效提高紅細(xì)胞的沉降速度，從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥
乙基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、
骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在
細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、
外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、
增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴(kuò)增分化過程中操作技術(shù)等多種因
素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀
法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對細(xì)胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體
反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞，然后再進(jìn)行離心分離單個核細(xì)胞，也取得不錯結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明采用隨機(jī)數(shù)字表法，將每份臍血隨機(jī)分入兩個不同處理組，從而將臍血樣本的個體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實(shí)，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用的羥乙已基淀粉商品名為
HES-TBD550（羥乙已已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時還阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙一基淀粉 550）處理后，可使紅細(xì)胞沉積至試管底，對其它主要成分包括干細(xì)胞無影響。經(jīng)這樣處理后，實(shí)驗(yàn)時間相對較短（平均為 1.5 h），步驟相對較少，細(xì)胞污染幾率小，從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明，與相應(yīng)的干細(xì)胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。
10.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備
注：：：：A.. .. 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化
酶種類各不相同，，，，請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。。。。
B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。。
剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至
勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)
(另購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm
短時低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并
調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血
清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108
-1×109個/ml 的單細(xì)胞懸液備用。
勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法
胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集
細(xì)胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液
洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測
細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108
-1×109 個
/ml 的單細(xì)胞懸液備用。
細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）
進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于
對培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。
計(jì)數(shù)與計(jì)算過程
1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。
2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至
蓋玻片被液體充滿為止。
3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，
對于細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：
細(xì)胞密度＝（4 個大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)
公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3
而 1ml＝1000mm3
細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：：
A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離
心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時，遇到 2 個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)
胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2
時，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。
B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時更要注意每次取樣都要混
勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；
D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時，只按照一個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)
胞壓在格線上時，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。
E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。
初學(xué)者易犯的錯誤： 初學(xué)者易犯的錯誤：：：
A． 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
B． 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
C． 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
貨號 品牌 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 報(bào)價
| LTS1110Z | TBD | 豬腫瘤浸潤組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1094 | TBD | 馬外周血淋巴細(xì)胞分離液 | 200ml | 400 |
| LTS1094P | TBD | 馬臟器組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1094Z | TBD | 馬腫瘤浸潤組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1087 | TBD | 羊外周血淋巴細(xì)胞分離液 | 200ml | 400 |
| LTS1087P | TBD | 羊臟器組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1087Z | TBD | 羊腫瘤浸潤組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1080F | TBD | 魚全血淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LTS1080FZ | TBD | 魚組織淋巴細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| 單個核細(xì)胞分離液 | ||||
| LDS1075 | TBD | 人全血單個核細(xì)胞分離液（FICOLL配置） | 200ml | 400 |
| LDS1075P | TBD | 人臟器組織單個核細(xì)胞分離液（FICOLL配置） | 100ml | 400 |
| LDS1075Z | TBD | 人腫瘤浸潤組織單個核細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LDS1080 | TBD | 大鼠全血單個核細(xì)胞分離液 | 200ml | 400 |
| LDS1080P | TBD | 大鼠臟器組織單個核細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
| LDS1080Z | TBD | 大鼠腫瘤浸潤組織單個核細(xì)胞分離液 | 100ml | 400 |
