LDS1083豚鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)
豚鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A．適用儀器
zui大離心力可達(dá)1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B．耗材
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產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)地 |
15ml離心管散裝 | 339650 | 美國(guó) NUNC |
15ml離心管架裝 | 339651 | 美國(guó) NUNC |
50ml離心管散裝 | 339652 | 美國(guó) NUNC |
50ml離心管架裝 | 339653 | 美國(guó) NUNC |
無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
一、使用15ml離心管時(shí)：
情況A：血液樣本量小于 3ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支15ml離心管，加入3ml分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件
需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)
核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況B：血液樣本量為3-6ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支15ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件
需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò)1000g）。
3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)
核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、使用50ml離心管時(shí)：
情況A：血液樣本量為6-10ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件
需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò)1200g）。
3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)
核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況B：血液樣本量為10-20ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件
需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò)1200g）。
3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)
核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復(fù)6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
在取血2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò)6h
后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3.吸取過(guò)多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的
粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4.吸取過(guò)多的單個(gè)核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5.如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)上海研謹(jǐn)以尋求幫助，具體
詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6.當(dāng)血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：
2010C1119）1:1稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣
本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期2年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸上海研謹(jǐn)生物公司搜索細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不 | 細(xì)胞密度過(guò)小 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離
心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準(zhǔn)。
